Una giornata in laboratorio

Soprattutto in chi viene alimentato ad arte a credere in una casta elitaria che ordisce cospirazioni ai loro danni, grazie anche a cattiva narrativa, spesso il lavoro compiuto all’interno di un qualsivoglia laboratorio sembra essere qualcosa di oscuro e recondito, che solo dei malvagi adepti dell’oscurità conoscono, magari per compiere chissà quali nefandezze.
Quindi ho pensato di illustrarvi un esempio di lavoretto comunemente svolto all’interno di un qualsiasi laboratorio (pubblico o privato, di analisi o ricerca specialistica, universitario o industriale, ecc.) da studenti, tirocinanti, borsisti, dottorandi, ricercatori ordinari, primari e così via in tutto il mondo.

Nella fattispecie farò riferimento al progetto a cui sta lavorando l’equipe con cui collaboro, cioè questo, ma non temete: sarà solo a titolo esemplificativo, per spiegare perché in laboratorio dobbiamo fare certe cose; non mi dilungherò su argomenti tanto noiosi come la biochimica delle piante o simili. Cercherò naturalmente di essere il più chiaro e semplice possibile, il mio intento è di illustrare solamente alcune delle procedure maggiormente comuni e diffuse nei laboratori di tutto il mondo, non di fossilizzarmi sulle prospettive di una ricerca particolare annoiandovi a morte. Ma se volete potete saltare e passare ai paragrafi successivi.

Prima di tutto va specificato che la biologia è un campo vastissimo, esistono laboratori che si concentrano su cose diversissime (biofisica, embriologia, biotecnologie ecc.) e quindi ciò che vi illustrerò è solo una parte di quel che si può fare.
In generale però ogni biologo che opera in un laboratorio deve essere un po’ anche un chimico, perché deve preparare composti che utilizzerà negli esperimenti e soprattutto deve sapere cosa sono, a cosa servono e come funzionano.
In verità questa parte dell’attività dei biologi tende a indurre un pizzico di ipocondria, ma se si rispettano tutte le precauzioni e norme di sicurezza non si corrono rischi:

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Ovviamente è sconsigliato maneggiare senza guantini, camice, attenzione e buon senso bottigliette e flaconi che contengono questi simboli di pericolo sopra. E bisogna fare attenzione anche allo smistamento di scarti e rifiuti, nonché a dove si mettono le mani (a proposito, se si deve uscire per trasportare qualcosa o maneggiare oggetti di uso comune, la mano impiegata non deve indossare i guanti utilizzati per maneggiare composti chimici onde evitare di depositarli, così come è avvenuto per maneggiare il telefono con cui sono state fatte queste foto che altrimenti rimarrebbe impregnato di chissà cosa). Questa è una parte che bisogna affrontare in tutti i laboratori e se pensate che il lavoro del biologo consista nel catalogare farfalle o nel dare la pappa alle scimmiette negli zoo (o nel clonare tirannosauri per la InGen) siete un po’ ottimisti.
Si consiglia anche di non provare a fare gli scemi mescolando sostanze a caso per “vedere che succede” (non potete sapere cosa accadrà e se magari non si svilupperanno vapori tossici o corrosivi) o provando a realizzare un esplosivo artigianale con la ricetta che il vostro amico della Svervegia vi ha dato (anche perché si tratta in genere di mezze trappole che vi esploderanno in mano di sicuro, ma è un altro discorso).

Per operare al meglio, gli strumenti del mestiere sono pochi e tutto sommato semplici da utilizzare: conoscete tutti ampolle, provette, becker, un po’ meno note sono le pipette, i pHmetri, gli agitatori magnetici o le bilancine tarate al milligrammo, necessari per preparare molte soluzioni, miscele o composti che verranno poi utilizzati.
Nella foto sotto vediamo un pHmetro, che ci indica il pH di una soluzione (può servire saperlo perché per esempio necessitiamo di un particolare pH per far avvenire una reazione chimica o per far disciogliere un soluto in un solvente, e per aggiustarlo possiamo utilizzare acidi come il cloruro d’idrogeno o basi come l’idrossido di sodio), un agitatore, che si utilizza per mescolare le soluzioni (vi si mette sopra un contenitore con la stessa e in più un particolare confettino che vortica per il campo magnetico del generatore) ed un piccolo spruzzino con acqua distillata, in questo caso per pulire il pHmetro dopo ogni utilizzo. Tagliato sulla destra c’è un contenitore dove gettare scarti e rifiuti, come le punte delle pipette, che sono strumenti utilizzati per prelevare campioni da 0.5 microlitri a un millilitro. Questi si trovano sotto una struttura detta cappa, che possiede un vetro e delle ventole e serve per proteggere l’operatore da effetti indesiderati, come polveri irritanti o esalazioni di gas nocivi.

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Lo strumento più importante di tutti è però probabilmente la pipetman, ne esistono vari tipi che possono prelevare volumi diversi di liquido e saranno l’attrezzo più utilizzato in assoluto in tutti i laboratori. Un biologo di laboratorio che non sa usare una pipetta è come un biologo che non sa usare un microscopio.

Ma veniamo a noi.

Lo studio condotto dal cordialissimo Christophe Robaglia è focalizzato su uno dei metodi con cui le piante, in risposta agli stimoli esterni (per esempio la disponibilità di cibo o le variazioni climatiche), adattano il loro metabolismo, cioè in pratica come esse adattano i meccanismi con cui regolano la propria crescita, le operazioni condotte all’interno delle cellule, le funzioni generali che permettono loro di vivere.
Questo perché ogni essere vivente non è una semplice presenza come le figure di una pellicola cinematografica, ma una “macchina” sofisticata e “ingegnosa”, un complesso intreccio di meccanismi chimici (e fisici) che permettono alla vita di sostenersi, crescere, prosperare e infine trasmettersi; la capacità della vita stessa di corrispondere a dei fenomeni che avvengono all’interno degli organismi secondo un certo equilibrio, nonché la capacità di adattarli e variarli a seconda delle diverse situazioni, è fondamentale affinché essa possa esistere nella maniera che conosciamo, tanto diversificata e complessificata – e cambiamenti in questi fenomeni possono dare origine a mutazioni, che possono anche causare estinzione o evoluzione, o a malattie, come per esempio il cancro.

Un esempio molto affascinante è dato dai cosiddetti ritmi circadiani. La periodicità del mondo fisico (l’alternanza di giorno e notte, ma anche le fasi lunari o altro) si riflette nel comportamento di molti organismi, che possono regolare i propri processi fisiologici a seconda di questi periodi. Le piante, nella fattispecie, sono molto sensibili alla presenza di luce, basti pensare ai girasole (un comportamento detto fototropismo in fisiologia vegetale), oppure al contrario alle belle di notte che dischiudono i fiori solamente dopo il tramonto. Vi chiederete, dunque come accade ciò? Come fanno a dare simili risposte?

Lo studio che vi ho linkato vuole investigare su come una particolare proteina, chiamata TOR (che sta per “target of rapamycin”, perché è stata identificata utilizzando una sostanza chiamata rapamicina), riesce a regolare varie funzioni all’interno della pianta. La proteina TOR sembra avere a che fare con un sacco di attività, compresi i ritmi circadiani, ma quello che al laboratorio marsigliese interessa è il suo ruolo come intermediario nel far adattare la pianta a condizioni di diverse quantità di energia e nutrienti disponibili. In poche parole, come la pianta reagisce a seconda se ci sia pappa o meno.
Le piante possono infatti aggiustare il loro programma di sviluppo a seconda delle perturbazioni e fluttuazioni nell’ambiente. A differenza degli animali che principalmente acquistano nuovi organi durante lo sviluppo embrionale o larvale, le piante hanno un piano di sviluppo plastico e producono gli organi nel corso della loro vita. Per esempio, la mancanza di fosforo induce la produzione di radici specializzate (a grappolo) per ricercare nel suolo I nutrienti disponibili. La mancanza di azoto innesca la formazione di noduli simbiontici nelle leguminose e stimola anch’essa le radici. La luce inoltre attiva complesse risposte di sviluppo che conducono ad una efficienza fotosintetica ottimizzata.
La TOR quindi sembra proprio controllare un gran numero di processi metabolici e di sviluppo e, dato che si è conservata identica anche in molti altri organismi come gli animali (uomo compreso), l’interesse è di capire come funzioni soprattutto in caso possano esservi eventuali ricadute sulla comprensione della nostra fisiologia – pare per esempio che possa avere qualche ruolo nella proliferazione tumorale.

Il primo passo è naturalmente quello di scegliere una pianta e coltivarla:

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Ma non si sceglie una pianta a caso, bisogna vedere quale può risultare più utile in funzione del proprio lavoro e ce n’è una specifica che i ricercatori adoperano spessissimo quando devono compiere studi sui vegetali: il suo nome scientifico è Arabidopsis thaliana, meglio nota come arabetta comune, ed è quello che in gergo viene chiamato organismo modello, cioè una specie che per le sue caratteristiche viene intensamente e privilegiatamente impiegata per studiare determinati fenomeni biologici. Fra le caratteristiche vi è, innanzitutto, la facilità con cui si può disporre di tale organismo, deve cioè per esempio occupare poco spazio, crescere in fretta e richiedere poco per essere mantenuta; fra gli animali, il modello più famoso è sicuramente quello del moscerino della frutta utilizzato per gli studi sulla genetica, mentre fra i microrganismi è senza dubbio Escherichia coli. Ma deve essere importante anche la possibilità che le scoperte possano valere anche per altre specie, possibile quando esse hanno in comune una parte del genoma, cioè l’insieme dei cromosomi contenente il DNA con tutti i geni. Nella ricerca biomedica si impiegano per esempio topi geneticamente modificati di modo da non esprimere alcuni geni che in questo modo possono far manifestare malattie molto gravi, come quelle neurodegenerative, che altrimenti sarebbe difficile se non infattibile studiare (anche solo per i numeri esigui di casi).
L’arabetta ha anche un altro vantaggio, ha cioè un DNA molto corto, il che vuol dire che è facile non solo analizzarlo e capire quali sono i suoi geni e come funzionano, ma anche manipolarlo per ottenere effetti determinati. Gli esemplari con cui ho a che fare infatti sono tutti organismi geneticamente modificati (OGM), sono stati infatti ingegnerizzati in precedenza mediante una tecnica biotecnologica che sfrutta un microbo di nome Agrobacterium thumefaciens (sulla quale non mi dilungo e di cui magari vi parlerò un’altra volta) per esprimere una misura maggiore dei geni responsabili della sintesi della proteina TOR. Ciò allo scopo di ottimizzare le analisi e avere più materiale a disposizione.
Gli ambientalisti non si preoccupino: non esiste possibilità di contaminazione dell’ambiente esterno, essendo presenti varie precauzioni di profilassi per mantenere le piante isolate e impedire l’uscita di semi. Si attuano nei laboratori di tutto il mondo – gli OGM a scopo di ricerca sono utilizzati dovunque e non solo nelle cripte segrete di Monsanto.

La “raccolta” è molto semplice, si tratta solamente di tagliare alcune giovani foglie piccoline e stiparle in contenitorini numerati. Bisogna fare attenzione a non contaminare i campioni, per esempio con polveri o sostanze chimiche, ma anche a non mescolare foglie di piante diverse per non falsare i risultati.
Il problema principale a cui però bisogna fare attenzione a questo punto è di natura biochimica: all’interno delle cellule esistono molecole, come le proteasi, che sono capaci di smantellare le proteine nei loro componenti fondamentali, cioè gli amminoacidi. Se noi vogliamo condurre analisi su di una proteina, dobbiamo assolutamente evitare quindi che questa proteina venga degradata. Per fare ciò esistono vari metodi, dalla variazione del pH all’utilizzo di detergenti appositi, ma in genere si varia la temperatura. Le proteasi e le molecole analoghe sono enzimi, cioè composti capaci di facilitare una reazione chimica (come il degrado di una proteina) abbassando la quantità di energia richiesta per farla avvenire. Richiedono per operare una determinata temperatura, senza la quale non riescono a catalizzare, cioè far avvenire e velocizzare, la reazione chimica; per questo si raffredda la temperatura dei campioni fino a livelli in cui questi enzimi non operano più.
Il problema è che per raggiungere la temperatura richiesta in questo caso si deve utilizzare l’azoto liquido, nel quale vengono riposti i campioncini, che poi dovranno essere presi a mano e anche con i guantini non è piacevole per le dita:


E bisogna tenerci i campioncini il più a lungo possibile e compiendo le operazioni successive in fretta, per evitare che la temperatura si alzi troppo e le proteasi digeriscano le proteine che ci interessa studiare.
Si consiglia di evitare di versarselo addosso e di non provare a fare gli scemi facendo a gara con l’amico svervegese a chi tiene il dito dentro più a lungo possibile. Si consiglia anche di non soffiarci dentro, soprattutto se avete occhiali, perché viene fuori tutta una nube di vapore (innocua) e non si vedrà più una ceppa.

Comunque, il passo successivo è di raccogliere i campioni congelati, frantumare le foglioline con un mortaretto e aggiungere una sostanza che abbia funzione sia di colorante che di tensioattivi. Un tensioattivo o surfattante, in chimica, è una sostanza che, detto terra-terra, ad un capo attira l’acqua, dall’altro la respinge. Un esempio sono i saponi, che per la precisione sono sali di acidi grassi. I tensioattivi possono formare bolle, dette micelle, con il lato idrofilo rivolto verso l’esterno e una zona idrofoba interna, nella quale possono essere inglobate occasionalmente molecole (il principio è lo stesso delle emulsioni d’olio o con alcune differenze della membrana cellulare). Ciò torna utile quando essi possono inglobare, e quindi isolare, le proteine, comprese quelle che vogliamo studiare. Una volta isolate, non è più neanche necessario mantenere temperature basse per evitare indesiderate digestioni proteiche.

I campioni a questo punto vengono centrifugati, filtrati dei residui macroscopici non solubilizzabili e diluiti per avere dei flaconi ciascuno con approsimativamente la stessa concentrazione di proteine (che viene determinata con varie tecniche come utilizzando uno spettroscopio) ed una quantità sufficiente di liquido per condurre vari esperimenti.

A questo punto si puo’ procedere con l’elettroforesi, croce e delizia per gli studenti ad ogni esame di biochimica. Si tratta di una tecnica che ci consente di separare le proteine, e magari di vedere se ne sono presenti di particolari. Il suo principio si basa sul fatto che un flusso elettrico tende ad attrarre (o respingere) delle molecole a seconda della loro carica elettrica. Se ricordate la fisica del liceo, la carica elettrica può essere negativa o positiva, e quando due cariche sono opposte si attraggono, altrimenti si respingono. Per l’elettroforesi si usa in genere una corrente elettrica positiva, che può quindi attirare cariche elettriche negative, spostandole. Le proteine presentano delle cariche, a livello dei singoli amminoacidi, che però possono essere positive o negative. Per poter far in modo che la corrente agisca in maniera uniforme su di esse, dobbiamo fare in modo che abbiano tutte la stessa carica (in questo caso negativa); altrimenti alcune verranno attratte, altre respinte, altre magari rimarranno ferme. Inoltre dobbiamo trovare un modo per separarle, perché se tutte semplicemente si spostassero da un punto A ad uno B in cui c’è una sorgente elettrica non avremmo combinato nulla.

Entra in gioco adesso un gel, molliccio (e tossico quindi sempre usare i guantini nel prepararlo), le cui componenti principali sono una sostanza detta acrilammide ed un tensioattivo, il sodio dodecil sosfato o SDS, più noto con il nome commerciale di sodio lauryl sulfato. Se l’avete già sentito nominare, vi facilito dove andare a ritrovarlo: è nei vostri shampoo e bagnoschiuma. Come per l’isolamento proteico di prima, l’SDS tende ad inglobare le proteine, e risulta molto comodo e utile perché ogni molecola ne “maschera” la carica elettrica effettiva esponendo all’esterno solo la propria parte carica negativamente. In questo modo tutte le proteine risultano apparentemente essere circondate da una carica negativa e la corrente positiva può attrarle. Spero sia abbastanza chiaro.
Abbiamo così un metodo per spostare facilmente ed efficaciemente le proteine, per separarle utilizziamo l’acrilammide, che è la componente che da la consistenza al gel e che ha la caratteristica di essere composto da tanti piccoli pori. A seconda della quantità di acrilammide aggiunta, i pori possono essere più o meno grandi. Ciò diviene importantissimo perché se potessimo far passare, sfruttando il principio della corrente elettrica di sopra, le proteine in questo gel, potremmo avere un metodo per distinguerle: infatti quelle più grandi faticheranno a filtrare nei pori, quelle più piccole vi passeranno lentamente e quelle più piccole ancora attraverseranno subito il gel.
Per fare ciò bisogna preparare dei vetrini appositi, in cui inserire il gel (di cui esistono due tipi, uno detto “running gel” che filtra le proteine ed un altro detto “stacking gel” in cui invece vanno depositati piccole quantità di campione). Sono più o meno così:

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Il pettinino verde serve a dare la forma a dei “pozzi” nello “stacking gel”, perché in ogni pozzetto verrà iniettato un campione diverso. Così nel primo ci sarà il campione proveniente dalla pianta 1, nel secondo quello dalla pianta 2 e così via. Ovviamente prima si rimuoverà il pettinino, ma non subito, perché il gel all’inizio è liquido e bisogna attendere che “polimerizzi”. La corrente elettrica farà avanzare i campioncini verso il fondo, dando origine a varie bande in corrispondenza dei punti in cui le proteine di una determinata massa non riescono a passare e si fermano o vengono rallentate.
Nell’ultimo pozzetto si mette una sostanza colorante proteica, detta marker, che contiene delle proteine dalle dimensioni note (il cosiddetto peso molecolare, che si misura in dalton) che si fermeranno in determinati punti dicendoci quindi a quale massa corrisponde quel livello (e le proteine dei campioni che hanno lasciato una banda allo stesso punto.
Il vetrino con i campioni viene poi inserito all’interno di una scatola particolare che consente di far avviare la corrente elettrica e che viene riempita di una soluzione contenente SDS che funge anche da conduttore, essendo un sale (perché i sali si possono “dissociare” in una parte carica negativamente ed una positivamente, niente di meglio per un flusso elettrico per procedere):

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Attivata la corrente, si dice che viene avviata la “corsa” delle proteine. Che prima o poi raggiungeranno il fondo. A quel punto si spegne tutto, si smonta l’apparecchiatura, si estrae delicatamente il gel (per evitare di romperlo essendo molto fragile) in cui sono stati precedentemente aggiunti dei microcampioni e a seconda di cosa vogliamo fare esso può avere destini differenti.

In genere si preparano due gel identici con le medesime quantità degli stessi campioni, come potete vedere bene dalla prima foto sopra, per effettuare due possibili operazioni allo stesso giro. Nella prima si prende il gel, lo si immerge in alcune soluzioni fissatrici che ci aiutano tingendo le zone del gel in cui le proteine si sono accumulate, dato che altrimenti non potremmo vederle:

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Il risultato, se siete dei gran fighi e tutto è andato bene, è qualcosa di questo genere:

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Le varie bande sono proteine, quella più spessa al centro essendo di un campione vegetale se non erro dovrebbe consistere nella subunità maggiore dell’enzima rubisco, che però non ci interessa per il nostro lavoro. A destra nella foto non si vede bene ma ci sono le bande del marker, che messe a confronto con una scala a disposizione indicano più o meno il peso molecolare che corrisponde a quei punti.

Se siete dei pirla, o qualcosa va storto, o il vostro collega della Svervegia vi starnutisce sui preparati, vi uscirà qualcosa di questo genere:

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I vari gel elettroforetici sono delicati, quindi li si inserisce in involucri di plastica per evitarne il disseccamento e l’usura. Si possono conservare, e c’è chi li collezione come si fa con i francobolli o le farfalle, cosa che onestamente non ritengo sia una grande ambizione nella vita ma ognuno occupa il proprio tempo come può.

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Con questa tecnica, possiamo visualizzare le proteine che erano presenti nei nostri campioni e stimarne dimensioni e peso.

In alternativa, invece della fissazione, si procede con un’altra operazione chiamata western blot: essa consiste nell’identificare sul nostro gel una particolare proteina, utilizzando degli anticorpi che si legano solo ad essa e poi delle sostanze bioluminescenti per renderle visibili.
Il primo passo è quello del trasferimento, con cui le proteine che hanno “corso” sul gel vengono impresse su di una membrana speciale. L’apparecchiatura è simile a quella dell’elettroforesi perché si utilizza ancora una corrente elettrica, ma si utilizzano sostanze diverse ed un contenitorino con delle spugnette in cui inserire il gel e la membrana. Questi ultimi vengono orientati di modo che il flusso elettrico passi dal gel alla membrana, facendo percorrere lo stesso tragitto alle proteine:

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Il ghiaccio serve perché viene generato molto calore.
Dopodiché si preleva la membrana e la si sottopone a vari cicli di lavaggio e “bloccaggio”, con i quali si aggiungono gli anticorpi che poi aderiranno sulla membrana alle proteine ricercate. Si utilizzano anticorpi di tipo primario e secondario, i primi si legano uno ad ogni proteina, i secondi si legano agli anticorpi primari e, dato che se ne legano molti, al momento della colorazione avremo un contrasto più netto:

https://i0.wp.com/www.pierce-antibodies.com/images/prodvalimagenew/PA5-20123_WesternBlot.jpg

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Come interpretare poi tutto questo e organizzare nuovi esperimenti?
Beh, esistono corsi di laurea appositi in cui fare tutto ciò e non intendo certo mettermi a fare il lavoro altrui qua. Per quanto riguarda i risultati, lo studio linkato all’inizio è un esempio di cosa si riesce a capire anche con esperimenti tutto sommato semplici (ma con mille accorgimenti da prendere) con questi; ora si tratta di proseguire nelle indagini, fare ipotesi, vedere se i dati raccolti le supportano o smentiscono ed in caso aggiustare il proprio modello descrittivo che spiega quanto osservato.

Naturalmente, come già detto all’inizio, questa è solo una frazione di ciò che si fa all’interno dell’immenso mondo della biologia. Esistono molti altri esperimenti e routine (saggi elisa, southern blot, pcr, coltivazioni di colture, trasferimenti genici ecc.), che magari vi descriverò in futuro se avrò voglia o vi descriveranno altri, se non sono già stati descritti.
Ho solo voluto rendervi partecipi per un attimo del lavoro del biologo e mostrarvi come nel mondo della ricerca non ci sia nulla di strano o astruso (anzi: cose “approssimative” come l’utilizzare pezzi di carta, fili di ferro, siringhine o il riciclare composti usati sono comuni), ma con cui ottenere grandi cose.

(articolo pubblicato anche su i Discutibili)

3 pensieri su “Una giornata in laboratorio

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